Kỹ thuật chẩn đoán nhanh bệnh tôm

 

Tôm thẻ chân trắng. Ảnh: cefas.co.uk

 

Kỹ thuật LAMP là viết tắt của từ Loop-Mediated Isothermal Amplification có nghĩa là sự khuếch đại ADN ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng (móc hay kẹp tóc). LAMP được phát triển đầu tiên vào năm 2000 bởi nhóm tác giả người Nhật. Dù mới được giới thiệu ra mắt hơn 20 năm nhưng LAMP cũng đã được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực trong đó có chẩn đoán bệnh trên tôm.

Kỹ thuật LAMP đã được phát triển và sử dụng trong chẩn đoán nhiều bệnh trên động vật thủy sản (cá, tôm), vì phương pháp này có thể được thực hiện và hoàn thành trong vòng 1 giờ, nó sẽ rút ngắn thời gian phát hiện mầm bệnh cũng như đã được chứng minh có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Đặc biệt thử nghiệm kỹ thuật LAMP đã được áp dụng để phát hiện tác nhân gây bệnh truyền nhiễm trên tôm, bao gồm vi khuẩn, vi bào tử trùng, virus (ADN, ARN),… Với kỹ thuật này có thể phân tích được đa dạng các loại mẫu bệnh phẩm như gan tụy, mang, ruột, máu, cơ, phân tôm, hay mẫu nước và mẫu bùng.

 

  

Kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh trên tôm (Kumar et al., 2021)

Trong những năm gần đây, sự xuất hiện rộng rãi của EHP đặt ra một thách thức đáng kể đối với ngành công nghiệp nuôi tôm. Chẩn đoán sớm, nhanh chóng và chính xác nhiễm trùng EHP là rất cần thiết để kiểm soát thiệt hại. Thử nghiệm LAMP được thực hiện trên trình tự gen mã hóa protein vách bào tử của EHP. Kỹ thuật LAMP này hiệu quả trong việc phát hiện mầm bệnh EHP ở tất cả mẫu lâm sàng bao gồm gan tụy tôm, mẫu tôm, phân, nước ao và đất. LAMP cho độ nhạy 100% và tính chuyên biệt 100% cùng với sự đánh giá bằng kết quả điện di trên gel. Quá trình xét nghiệm diễn ra nhanh chóng, có thể phát hiện mầm bệnh EHP trong vòng 40 phút và không yêu cầu bất kỳ dụng cụ đắt tiền và trình độ kỹ thuật. 

 

  

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) là một bệnh nghiêm trọng trên tôm và gây thiệt hại đáng kể cho ngành nuôi tôm. Tác nhân gây bệnh AHPND đã được xác định là Vibrio parahaemolyticus mang gen độc lực.

 

  

Tôm bị hoại tử gan tụy. Ảnh: tanilogic.com

 

Hai bộ mồi (LAMP-A2 và LAMP-A3) đã được phát triển và xác nhận để sử dụng trong xét nghiệm LAMP nhằm xác định V. parahaemolyticus gây AHPND (VpAHPND). LAMP-A2 và LAMP-A3 đã phát hiện được tất cả 33 chủng VpAHPND. Giới hạn phát hiện của LAMP-A3 là 53 CFU/ml hoặc 0,1 CFU/phản ứng (thấp hơn 10 lần so với LAMP-A2), trong xét nghiệm tôm giống giới hạn phát hiện là 4,4.105 CFU/ml hoặc 8,8.102 CFU/phản ứng. Thử nghiệm thêm đối với 24 mẫu hậu ấu trùng, tôm, trầm tích và nước được thu thập từ một trại nuôi tôm cho thấy VpAHPND được phát hiện hầu hết trong các mẫu trầm tích. Như vậy, các kết quả cho thấy rằng xét nghiệm LAMP dựa trên LAMP-A3, phù hợp để xác định V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trên tôm.

Sử dụng phương pháp LAMP, một hệ thống chẩn đoán có độ nhạy và đặc hiệu cao để phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) đã được thực hiện.

 

  

Tôm bị bệnh đốm trắng. Ảnh: abc.net.au

 

Một bộ bốn mồi, hai mồi ngoài và hai mồi trong, được thiết kế từ DNA bộ gen WSSV. Thời gian và nhiệt độ phản ứng được tối ưu hóa trong 60 phút ở 65°C, tương ứng. Giới hạn phát hiện trong phương pháp LAMP này lên đến 1 fg, trong khi đó phương pháp Nested PCR với độ nhạy 10 fg. Do đó, quy trình LAMP chuẩn hóa đã được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của WSSV trong tim, dạ dày và cơ quan bạch huyết từ tôm bị nhiễm bệnh. Nghiên cứu đã phát triển một quy trình chẩn đoán nhanh chóng và có độ nhạy cao để phát hiện WSSV ở tôm.

Kỹ thuật LAMP đã được áp dụng để phát hiện bệnh còi do baculovirus Penaeus monodon (MBV), một loại virus gây bệnh phổ biến trong các trại sản xuất tôm giống. Điều kiện thời gian và nhiệt độ tối ưu cho LAMP lần lượt là 60 phút và 63oC. Kỹ thuật này có tính đặc hiệu cao đối với MBV và kết quả âm tính đối với các loài virus khác gây bệnh trên tôm, bao gồm WSSV, IHHNV và HPV. Độ nhạy của LAMP là 10 pg/ml ADN hoặc 10 fg/pứ và nhạy hơn 10 lần so với PCR thông thường trong việc phát hiện MBV đối với mẫu tôm giống.

Kỹ thuật LAMP được áp dụng để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô trên tôm thông qua bốn đoạn mồi được thiết kế dựa vào DNA địch của bộ gen IHHNV. DNA đích được khuếch đại và hiển thị trên gel agarose trong vòng 60 phút ở điều kiện đẳng nhiệt ở 64°C.

Ngoài ra, sản phẩm LAMP cũng được xác định bằng cách thêm SYBR Green I để kiểm tra bằng mắt thường. Phản ứng LAMP cũng được đánh giá bằng độ đục màu trắng của magie pyrophosphat. Xét nghiệm có giới hạn phát hiện là 5–500 bản sao của DNA khuôn thông qua đọc kết quả bằng điện di trên gel, SYBR Green I và độ đục trắng khi kiểm tra bằng mắt thường. Độ nhạy phát hiện của LAMP cao hơn 100 lần so với PCR. 

Xét nghiệm khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian phiên mã ngược (RT-LAMP) được phát triển để phát hiện gen glycoprotein cấu trúc của virus đầu vàng (YHV). Xét nghiệm RT-LAMP là một phương pháp khuếch đại gen mới giúp khuếch đại axit nucleic với độ đặc hiệu và độ nhạy cao và nhanh chóng trong điều kiện đẳng nhiệt với một bộ bốn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận biết sáu trình tự khác nhau của mục tiêu.

Toàn bộ quy trình rất đơn giản và nhanh chóng, thời gian và nhiệt độ phản ứng được tối ưu hóa trong 60 phút ở 65oC, tương ứng. Phát hiện gen khuếch đại có thể được thực hiện bằng điện di trên gel agarose. Quy trình RT-LAMP chuẩn hóa được sử dụng để phát hiện YHV trong máu và mang từ tôm bị nhiễm bệnh. Đồng thời xác định độ nhạy của kỹ thuật RT-LAMP thì khi tôm nhiễm YHV RT-LAMP được phát hiện ở nồng độ của độ pha loãng 10−6, trong khi Nested RT-PCR phát hiện ở độ pha loãng 10−7, kết quả này cho thấy độ nhạy RT-LAMP chỉ thấp hơn 10 lần so với Nested RT-PCR. Đối với tính đặc hiệu của RT-LAMP thì kết quả hoàn toàn âm tính với WSSV, TSV và RNA của tôm, điều này chứng tỏ phương pháp RT-LAMP có độ đặc hiệu cao đối với YHV. Do đó, kỹ thuật RT-LAMP cực kỳ nhanh chóng, tiết kiệm chi phí, độ nhạy và tính chuyên biệt cao, có tiềm năng hữu ích cho chẩn đoán nhanh để phát hiện YHV trên tôm.

 

  

Sơ đồ của hai mồi bên trong (FIP và BIP) và hai mồi bên ngoài (F3 và B3) cho RT-LAMP (A). Trình tự nucleotide của gen glycoprotein cấu trúc YHV được sử dụng cho các đoạn mồi bên trong và bên ngoài (B) (Nguồn: Mekata et al., 2006)

  

 

Phương pháp RT-LAMP chẩn đoán virus gây hội chứng Taura là một tác nhân gây bệnh ở tôm thẻ chân trắng. Điều kiện thời gian và nhiệt độ để phát hiện TSV được tối ưu hóa trong 60 phút ở 63°C. Tính chuyên biệt của kỹ thuật này được thực hiện trên các axit nucleic của các mầm bệnh tôm khác (YHV, WSSV) đều cho kết quả âm tính. Việc phát hiện TSV bằng RT-LAMP nhạy hơn 10 lần so với RT-PCR nhưng kém nhạy hơn Nested RT-PCR. Tuy nhiên, phương pháp này thuận tiện hơn, nhanh chóng và không yêu cầu máy PCR phức tạp.

Thời gian thực hiện LAMP nhanh hơn so với PCR. Theo đó, thời gian thực hiện PCR trung bình khoảng 2,5-3 giờ, trong khi thời gian thực hiện LAMP trung bình khoảng 1-1,5 giờ. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc chẩn đoán và xác định bệnh nhanh;

Kết quả của phản ứng LAMP có thể được quan sát ngay dưới ánh sáng thường hoặc soi dưới tia UV.

Hệ thống LAMP không yêu cầu nhiều thiết bị như máy luân nhiệt và chu trình nhiệt. Hơn nữa, hệ thống này không cần đến năng lượng điện (vì có thể sử dụng túi ấm hoặc túi giữ nhiệt). Do đó, có thể giảm được thời gian vận chuyển, phát hiện nhanh, có tính di động và hiệu quả kinh tế cao. Phù hợp với những vùng đang còn thiếu thốn về cơ sở hạ tầng cũng như yếu kém về khoa học công nghệ.

Hồng Huyền @hong-huyen

Đăng ngày: 08/12/2022